HPLC-Säulen

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Chromatographiesäulen für die Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC), sind das Hauptwerkzeug für analytische Trennungen. Die Auswahl an HPLC-Säulen ist sehr groß und es gibt vielfältige Entscheidungskriterien. In unserem Shop finden Sie aktuell mehr als 220.000 Chromatographieprodukte. Unser umfangreiches Sortiment an HPLC-Säulen von über 100 HPLC-Säulenhersteller umfasst verschiedene Phasenchemien, Partikelgrößen, Säulenlängen und Durchmesser, um sicherzustellen, dass wir für jede analytische Herausforderung die passende Lösung bieten können. Egal, ob Sie nach einer Säule für die Routineanalyse, die Methodenentwicklung oder die Hochdurchsatzanalyse suchen - bei uns werden Sie fündig!

Unser erfahrenes Team mit Hersteller Know-How steht Ihnen mit Fachwissen und persönlicher Beratung zur Seite, um sicherzustellen, dass Sie die richtige HPLC-Säule für Ihre Anwendung auswählen. Sie wissen noch nicht wie bestimmte Parameter Ihre Trennung beeinflussen? Unter unseren Technischen Daten finden Sie Erklärungen zu vielen Eigenschaften von stationären Phasen.

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Technische Daten

Sind Sie noch unsicher welche Trenntechnik, Partikeltechnologie oder welches Füllmaterial Sie anwenden möchten, so helfen Ihnen unsere technischen Infoseiten. Arbeiten Sie nach vorgegebenen Arzneibuchmonographien, so haben wir eine Übersicht der USP- und Ph. Eur. Listings mit passenden HPLC-Säulen erstellt. Als HPLC-Säulen Hersteller haben wir das KnowHow Ihnen bei der Auswahl zu helfen und nach Ihren Kriterien die passendste HPLC-Säulen herauszusuchen.


Welche Parameter beeinflussen wie meine HPLC-Trennung?

Es gibt verschiedene Parameter, die Einfluss auf die Trennung haben. Hierzu zählen die Säulendimension (Länge und Innendurchmesser), die physikalischen Eigenschaften der stationären Phase (Porengröße, Partikelgröße, spezifische Oberfläche, etc.) und die chemischen Eigenschaften der stationären Phase (Art der Funktionalisierung, Kohlenstoffgehalt, Endcapping, Support-Material, Art der Polymerisierung, etc.). Im folgenden sollen verschiedene Parameter aufgegriffen werden und deren Einfluss auf die Trennung genauer beschrieben werden.


Einfluss der Säulendimension

Wie beeinflusst die Länge der Säule die Trennung?

Nimmt die Länge der Säule zu, erhöht sich auch die Retentionszeit der Analyten. Gleichzeitig zeigt eine längere Säule auch höhere Bodenzahlen. Die Beladbarkeit der Säule nimmt ebenfalls zu, da mehr Material vorhanden ist. Generell lässt sich sagen, dass je Länger eine Säule ist…

 

  • desto länger die Retentionszeit/Laufzeit.
  • desto höher die Bodenzahl.
  • desto höher die Auflösung.
  • desto höher die Beladbarkeit.
  • desto toleranter die Säule gegen dreckige Proben
  • desto höher die Stabilität (Anzahl der Injektionen).
  • desto höher der Gegendruck.

Wie beeinflusst der Innendurchmesser der Säule die Trennung?

Der Innendurchmesser der Säule hat keine direkte Auswirkung auf die Trennung, vorausgesetzt die Flussrate wird bei kleiner werdendem Innendurchmesser angepasst, sodass die lineare Fließgeschwindigkeit konstant bleibt. Ein kleinerer Innendurchmesser hat eine andere optimale Flussrate für die höchste Effizienz im Vergleich zu dickeren Säulen. Ein kleinerer Innendurchmesser erhöht zwar nicht die Bodenzahl aber führt zu schmäleren Peaks. Dadurch kann die Auflösung und die Nachweisgrenze erhöht werden. Generell lässt sich sagen, dass je schmaler (kleinerer Innendurchmesser) eine Säule ist…

 

  • desto schmäler die Peaks (höhere Auflösung).
  • desto höher sind die Nachweisgrenzen (kleinere Probenmengen möglich).
  • desto geringer der Lösungsmittelverbrauch.
  • desto geringer die optimale Flussrate.
  • desto geringer die Beladbarkeit.
  • desto höher der Gegendruck.
  • desto geringer die Stabilität.

Wie wähle ich die richtige Kombination von Länge und Innendurchmesser für meine Probe aus?

Mit den oben aufgeführten Vor- bzw. Nachteilen, können je nach Anforderung an Ihre Analytik verschiedene Dimensionen der Säule sinnvoll sein. Hier sollen einige typische Beispiele aufgeführt werden. Sollten Sie weitere Hilfe bei der Auswahl der passenden Dimension brauchen, kontaktieren Sie uns!

 

  • Sie analysieren sehr viele Proben an einem Tag und die Laufzeit beeinflusst den Probendurchsatz? → möglichst kürze und schmale Säule für kurze Analysezeiten (z.B. 50x2.1 mm), eventuell UHPLC-Säule
  • Sie analysieren nur wenige Proben und die Laufzeit spielt keine Rolle? → längere Säule und größerer Innendurchmesser für mehr Stabilität (mehr Injektionen, z.B. 250x4.6 mm)
  • Sie haben stark Matrix belastete Proben? → längere und dickere Säulen für höhere Beladbarkeit (z.B. 250x4.6 mm)
  • Sie betreiben Spurenanalytik und die Menge an Probe ist begrenzt? → möglichst kleine Säule für höhere Nachweisgrenze (z.B. 50x2.1 mm)
  • Sie betreiben MS-Detektion? → kleinere Innendurchmesser haben eine geringere Flussrate, was besser für MS ist (z.B. 250x2.1 mm)
  • Sie möchten die Kosten für Lösungsmittel reduzieren? → kürzere und schmälere Säulen (z.B. 50x2.1 mm)
  • Sie möchten möglichst viel Probe auf einmal injizieren (präparativ)? → möglichst lange und dicke Säule (z.B. 250x4.6 mm oder 250x20 mm), eventuell größere Partikel

 

Falls Sie verschiedene Anforderungen an eine Proben haben, bspw. sehr geringe Probenmenge aber stark Matrix belastet, kann ein Kompromiss notwendig sein und die Wahl der passenden Säulendimension erschweren. In solchen Fällen ist es wichtig abzuwägen, was entscheidender für Ihre Analytik ist.


Einfluss von physikalischen Parametern der stationären Phase auf die Trennung

Zu den physikalischen Paramatern einer stationären Phase zählen die Partikelgröße, Porengröße, spezifische Oberfläche und Form der Partikel. Jeder dieser Parameter kann die Trennung beeinflussen.

Einfluss der Porengröße auf die Trennung

In erster Linie ist die Porengröße von der Größe der Analyten abhängig. In der HPLC sollen die Poren deutlich größer sein als die Analyten, da hier kein Ausschluss aus den Poren gewünscht ist. In der Größenausschlusschromatographie sind die Poren einer der wichtigsten Faktoren  und die Trennung erfolgt ausschließlich über den Ausschuss der Analyten aus den Poren. Meist lassen sich verschiedene Beziehungen zwischen Porengröße und Molekulargewicht finden.

 

  • 60 Å Poren für kleine Moleküle (bis ca. 1.000 Da)
  • 120 Å Poren für etwas größere Moleküle (bis ca. 10.000 Da)
  • 200 Å Poren für größere Moleküle (ca. 5.000 - 40.000 Da)
  • 300 Å und größerer Poren für große Moleküle (größer als 20.000 Da)

 

Dabei hängt der Molekulargewichtsbereich auch von der Form der Analyten ab und kann die hier angegebenen Werte beeinflussen.

 

Wie ändert nun die Porengröße die Trennung? Generell gilt, dass je kleiner die Poren sind, die spezifische Oberfläche zunimmt (z.B. PerfectSil 120 Å hat 300m²/g und PerfectSil 300 Å hat 100m²/g). Die größere Oberfläche hat dann eine längere Retention zur Folge. Auch die Diffusion der Analyten ist bei kleineren Poren erschwert, was wiederum auch zu einer Zunahme der Analysenzeit beitragen kann.

Einfluss der Partikelfrom auf die Trennung

Die Form der Partikel kann eine Trennung deutlich beeinflussen. Zunächst kann zwischen irregulären und sphärischen Partikeln unterschieden werden. Irreguläre Partikel haben einen höheren Gegendruck als sphärische Partikel und eine geringere Bodenzahl. Moderne HPLC-Phasen bestehen in der Regel immer aus sphärischen Partikeln. Eine weitere Form basiert ebenfalls auf sphärischen Partikeln besitzt jedoch einen nicht-porösen Kern und eine poröse Hülle. Diese sogenannten Core-Shell Partikel (Superficially Porous Particles, SPP) haben geringere Gegendrücke als sphärische Partikel und höhere Bodenzahlen. Jedoch ist hier die Beladbarkeit geringer im vergleich zu vollständig porösen Partikeln. Ein weiterer Punkt ist, dass Core-Shell Partikel einen schwächer ansteigenden Van-Deemter Plot aufweisen und dadurch höhere Flussraten bei hoher Bodenzahl möglich sind. Dadurch kann die Analysenzeit gesenkt werden ohne an Effizienz zu verlieren.

 

  • Gegendruck: irreguläre Partikel > sphärische Partikel > Core-Shell Partikel
  • Bodenzahl: Core-Shell Partikel > sphärische Partikel > irreguläre Partikel
  • Beladbarkeit: irreguläre Partikel ≈ sphärische Partikel > Core-Shell Partikel
  • Analysenzeit: Core-Shell Partikel < irreguläre Partikel ≈ sphärische Partikel

Einfluss der spezifischen Oberfläche auf die Trennung

Die spezifische Oberfläche ist zum Teil von der Porengröße abhängig. Tendenziell gilt, dass je kleiner die Poren, desto größer die Oberfläche. Manche Materialien weißen jedoch auch bei kleinen Poren nur eine geringe Oberfläche auf (z.B. Hypersil 120 Å und 170m²/g, PerfectSil 120 Å und 300m²/g). Eine größere spezifische Oberfläche bietet mehr Platz für die Analyten zum Diffundieren und daher sind die Retentionszeiten für größere Oberflächen auch länger. Außerdem bietet auch eine größere Oberfläche mehr Platz für funktionelle Gruppen, was zu stärkeneren Wechselwirkungen und wiederum einer längeren Retention führt. Generell gilt, dass je größer die Oberfläche …

 

  • desto länger die Retentionszeit (längere Diffusion und mehr Wechselwirkungen)

Einfluss der Partikelgröße auf die Trennung

Je kleiner die Partikel sind, desto höher ist die Bodenzahl aber umso höher ist der Gegendruck. Neben dem Nachteil des höheren Gegendrucks, muss auch bedacht werden, dass der Platz zwischen den Teilchen geringer wird und auch die Fritte, die die Partikel in der Säule hält, kleinere Poren aufweist. Dadurch sind Säulen mit kleineren Partikeln auch häufiger verstopft, im Vergleich zu größeren Partikeln. Dadurch ist die Beladbarkeit für kleinere Partikel tendenziell geringer. Außerdem ist mit einem höheren Gegendruck unter Umständen auch eine geringere Stabilität (weniger Injektionen) verbunden. Generell gilt, dass je kleiner die Partikel …

 

  • desto höher ist die Bodenzahl
  • desto höher ist der Gegendruck
  • desto geringer ist die Beladbarkeit
  • desto geringer kann unter Umständen die Stabilität sein
  • desto schneller neigt die Säule zum verstopfen

Einfluss von chemischen Parametern auf die Trennung

Zu den chemischen Parametern einer HPLC-Säule gehören die Art der Modifizierung, der Kohlenstoffgehalt, das Endcapping, die Art des Support-Materials und dessen Reinheit, die Art der Polymerisierung der Modifizierungen und die pH-Stabilität einer Phase. Alle diese Eigenschaften können einen großen Einfluss auf die Trennung bewirken. Im folgen sollen diese Eigenschaften im Bezug auf die Trennung beschrieben werden.

Einfluss der Art der Funktionalisierung auf die Trennung

Die Art der Funktionalisierung legt die Art der verwendeten Trenntechnik fest. Somit ist dies die wichtigste Eigenschaft einer HPLC-Säule. Wird eine C18-Gruppe als Modifizierung ausgewählt, ist die Umkehrphase dadurch die verwendete Trennmethode. Wurde sich bereits für eine Trenntechnik entschieden, gibt es verschiedene Möglichkeiten der Funktionalisierung. Die Wahl hängt dann von der Art der Analyten bzw. die Fähigkeit zum Wechselwirken der Analyten mit der Modifizierung ab. Sie wissen noch nicht welche Trenntechnik Sie verwenden möchten? Auf unserer Seite Trenntechniken finden Sie einige Auswahlhilfe, die die Wahl erleichtern sollen.

Einfluss des Kohlenstoffgehaltes auf die Trennung

Ein höherer Kohlenstoffgehalt gibt eine höhere Belegung der stationären Phase mit der Modifizierung an. Dadurch nimmt tendenziell auch die Wechselwirkung und somit die Retention zu. In einigen Fällen kann die Retention aber auch abnehmen. Als Beispiel hierfür soll eine C18-Phase dienen. Wird eine C18-Phase mit einer hohen Kohlenstoffbeladung ausgewählt, erhöht sich zwar die Wechselwirkung mit hydrophoben Analyten aber polarere Analyten können früher eluiert werden, da der Zugang zur polaren Oberfläche erschwert wird. Daher muss zusammen mit dem Kohlenstoffgehalt auch immer die Art der Modifizierung berücksichtigt werden. Falls es sich um eine polar modifizierte C18-Phase handelt, werden auch polarere Analyten bei höherem Kohlenstoffgehalt länger retardiert.

Einfluss des Endcappings auf die Trennung

Das Endcapping wird eingesetzt, um freie Silanol-Gruppen auf der Oberfläche zu reduzieren. Diese Silanol-Gruppen können zu ungewünschten sekundären Wechselwirkungen führen, die insbesondere bei Basen zu einem Tailing führen können. Das Endcapping kann auch dazu verwendet werden, um gezielt die Eigenschaften der stationären Phase zu ändern. Ein polares Endcapping bei einer C18-Phase ermöglicht beispielsweise beabsichtigte polare Wechselwirkungen. Wird ein sterisch anspruchsvolles Endcapping verwendet, kann die pH-Stabilität der Phase erhöht werden. Nicht endcappte Phasen haben ebenfalls polare Gruppen in Form der Silanole, was für manche Analyten auch vorteilhaft sein kann.

Einfluss des Support-Materials auf die Trennung

Als Support-Material wird das Grundgerüst der stationären Phase bezeichnet. In den meisten Fällen ist dies Silica. Jedoch können auch andere Materialien zum Einsatz kommen. Beispielsweise können Polymere für eine Vielzahl an verschiedenen Trenntechniken eingesetzt werden. Auch der Einsatz von Metalloxiden wie Zirconiumoxid sind möglich. Ebenfalls wird reines Kohlenstoff in Form von Graphit als stationäre Phase eingesetzt, was zu speziellen Retentionsmechanismen führt. Silica bietet den Vorteil, dass es relativ günstig und sehr druckstabil ist. Ein Nachteil ist jedoch die eingeschränkte pH-Stabilität bei etwa 2-8. Für manche Analyten kann es vorteilhaft sein, einen hohen pH-Wert zu verwenden (Retention von Basen). Dann würden sich Polymere als stationäre Phasen eignen. Hier besteht jedoch der Nachteil, dass die Polymere nicht so druckstabil sind und in verschiedenen Lösungsmitteln verschiedene Quelleigenschaften zeigen. Metalloxid- und Kohlenstoff-Säulen ermöglichen spezielle Wechselwirkungen. Hierzu sollten die Applikationen der Hersteller berücksichtigt werden, ob diese Phasen sich für eine bestimmte Trennung eignen.

Einfluss der Support-Reinheit auf die Trennung

Die Reinheit des Support-Materials spielt nur für Silica Materialien eine große Rolle. Insbesondere ältere Phasen (z.B. LiChrospher, Nucleosil, etc.) werden mit altem Silica-Gel, sogenanntem Typ-A Silica hergestellt. Diese Silica-Gele haben haben wesentliche Mengen an Übergangsmetallen im Grundgerüst. Diese Übergangsmetalle bewirken einen stark sauren Charakter bei den freien Silanolen. Das führt zu sehr starken polaren Wechselwirkungen dieser Silanole mit den Analyten. Daher eignen sich solche Typ-A Silica Materialien weniger für Basen. Moderne Phasen besitzen andere Silica-Quellen, wodurch die Übergangsmetalle deutlich reduziert werden. Hier spricht man von Typ-B Silica-Materialien. Diese Materialien haben weniger acide Silanol-Gruppen auf der Oberfläche, wodurch sich diese Phasen besser für Basen eignen. Jedoch kann der Umstieg von Typ-A auf Typ-B Silica-Materialien schwierig sein, da die stark polaren Wechselwirkungen der Typ-A Silica-Phasen wegfallen. Hier kann es sinnvoll sein polar modifizierte oder nicht-endcappte Phasen zu verwenden.

Einfluss der pH-Stabilität auf die Trennung

Die pH-Stabilität kann einen Einfluss haben, wenn die Analyten ionisierbar sind (Säuren/Basen). Während Basen im hohen pH-Bereich neutral vorliegen, sind Säuren bei niedrigen pH-Werten ungeladen. Dies kann erhebliche Auswirkungen auf die Wechselwirkungen haben. Da Silica-Säulen meist in einem pH-Bereich von 2-8 stabil sind, sind pH-Werte außerhalb dieses Bereichs eine Herausforderung. Durch verschiedene Methoden, kann der pH-Bereich einer Säule vergrößert werden. Sterische Liganden an den Modifizierungen können die Oberfläche abschirmen und diese so stabiler machen. Ebenfalls ein sterisches Endcapping kann zur Stabilität beitragen. Eine weitere Methode ist das einkapseln der Silica-Oberfläche mit einem Polymer oder die Synthese von Hybrid-Materialien, die die Stabilität erheblich vergrößern.

Einfluss der Polymerisierung auf die Trennung

Der Grad der Polymerisierung beschreibt, über wie viele Verbindungen die Modifizierung mit der Oberfläche verbunden ist. Möglich ist die Mono-, Di- und Trifunktionalisierung. Die Monofuntkionalisierung ist die häufigste Funktionalisierung. Dabei wird die Modifizierung über eine Bindung mit dem Silica-Gerüst verbunden. Bei Di- und Trifunktionalisierungen ist die Bindung an die Oberfläche über zwei bzw. drei Bindungen möglich. Hierbei kann zwischen einer horizontalen Polymerisierung und einer vertikalen Polymerisierung unterschieden werden. Bei der horizontalen Polymerisierung soll die Modifizierung über alle zur Verfügung stehenden Bindungen an die Oberfläche gebunden werden (geschieht über wasserfreie Lösungsmittel und hohe Temperaturen). Bei der vertikalen Polymerisierung wird über mehrere Schritte immer wieder Wasser hinzugegeben, was auch zum reagieren von bereits gebundenen Modifizierungen führt. Dabei wird eine dicke Schicht über der Silica Oberfläche erhalten. Die vertikale Polymerisierung liefert einen geringeren Kohlenstoffgehalt aber weniger freie Silanole. Eine horizontale Polymerisierung zeigt einen höheren Kohlenstoffgehalt aber mehr freie Silanole.

All diese chemischen Eigenschaften beeinflussen die Trennung vornehmlich in der Selektivität. Es lassen sich somit keine allgemein gültigen Regeln formulieren, da der Einfluss eines Parameters auch immer von den Analyten und der mobilen Phase abhängt. Die Selektivität hat den größten Einfluss auf eine Trennung ist aber am schwierigsten vorherzusagen. Eine genauere Übersicht über den Einfluss auf die Auflösung bietet unsere Seite Methodenentwicklung. Um geeignete chemische Parameter einer Säule herauszufinden, empfiehlt sich zunächst eine Applikationsrecherche, um identische oder ähnliche Anwendungen zu finden. Hierbei unterstützen wie Sie gerne. Kontaktieren Sie uns! Alternativ finden Sie auf unserer Seite Trenntechniken weitere Informationen zur Auswahl der passenden Trennmethode.

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