HPLC USP-Methoden

Adjustments - Anpassungen nach USP Kapitel 621

Anwender aus dem regulierten Umfeld (z. B. der Pharmaindustrie) sind vielfach an sogenannte Monographie-Methoden der europäischen- oder US-Pharmakopöe (Ph. Eur. bzw. USP) gebunden. Die in den Arzneibüchern festgelegten Spezifikationen für die Analytik der zu untersuchenden Stoffe müssen befolgt werden. Diese sind hauptsächlich im Kapitel 621 der USP festgehalten.

Das Kapitel 621 der USP beinhaltet ausdrücklich praxisnahe Empfehlungen, welche Abweichungen von Spezifikationen der Methode in einer Monografie erlaubt, ohne dass eine Revaliderung der Methode erforderlich ist. Das „Adjustment“ (Anpassung) gilt als notwendig für die Erfüllung der Systemeignungstests-(SST)-Kriterien. Die erlaubten Änderungen sollen im Folgenden genauer erklärt und anschließend Beispiele geliefert werden.

Anpassungen der USP <621> zum 01.12.2022 (01.01.2023 für Ph. Eur., JP, BP) erlauben nun erstmals Änderungen bei Gradienten Methoden. Diese Änderungen waren bisher ohne eine Revalidierung nicht erlaubt. Durch diese Änderungen können kleinere Partikel oder Core-Shell Partikel (Superficially Porous Particles, SPP) bei Gradienten verwendet werden, was die Produktivität in einem Labor erhöhen kann.

Technische Daten

Änderung der Stationären Phase

Änderungen der stationären Phase sind grundsätzlich erlaubt. Dabei muss jedoch die L-Kategorie der USP beibehalten und darf nicht verändert werden.

Änderung der Säulendimension

Eine Abänderung der Säulendimension (Länge, Innendurchmesser und Partikelgröße) ist in einem bestimmten Rahmen möglich. Die Grenzen für die Änderung der Abmessungen variiert je nach Methode (isokratisch oder Gradient) und basierend darauf, ob ein vollständig poröses Material (Totally Porous Particle, TPP oder Fully Porous Particle, FPP) durch einen Core-Shell Partikel (SPP) ausgetauscht werden soll. Die Bedingungen beziehen sich dabei lediglich auf die Länge und die Partikelgröße. Der Innendurchmesser kann frei gewählt werden.

TPP zu TPP bei Isokratischen und Gradienten Methoden

Für die Berechnungen der Kriterien wird die Länge (L) und die Partikelgröße (dp) benötigt.

L/dp: von -25% bis +50%

Zunächst sollte dieser Quotient für die in der USP empfohlene Säule berechnet werden. Dieses Ergebnis ist der Ausgangspunkt für den Bereich -25% bis +50%. Bei einer Säule mit einer anderen Abmessung sollte L/dp im ermitteltem Bereich liegen.

TPP zu SPP bei Isokratischen Methoden

Bei einem Wechsel von vollständig porösen zu Core-Shell Materialien, wird ein anderes Kriterium für die Änderung der Dimension herangezogen. Hier ist die Bodenzahl N der wichtigste Faktor.

N: -25% bis +50%

Dabei wird die Bodenzahl der ursprünglichen USP Methoden ermittelt und mit der Bodenzahl der Core-Shell Säule verglichen. Dabei muss das Verhältnis von L/dp nicht im Bereich von -25 bis +50% liegen.

TPP zu SPP bei Gradienten Methoden

Gradienten Methoden erlauben nicht die einfache Bestimmung der Bodenzahl und daher kommt ein weiteres Kriterium zum Einsatz. Dabei wird die Retentionszeit t_Rins Verhältnis mit der Breite auf halber Höhe gesetzt W_h.

(t_R/W_h)²: -25% bis +50%

In diesem Fall wird dieses Verhältnis wieder mit der ursprünglichen Methode der USP verglichen. Wie bei isokratischen Methoden muss hier das Verhältnis von L/dp nicht im Bereich von -25 bis +50% liegen.

Anpassung der Flussgeschwindigkeit

Wurde die Dimension der Säule geändert, zieht dies Anpassungen in der Flussgeschwindigkeit (Flussrate) mit sich. Dabei kann die Flussrate für die neuen Säulenabmessungen basierend auf den ursprünglich Werten berechnet werden. Für die Berechnung der neuen Flussrate kommt folgende Formel zum Einsatz:

F_{2} = F_{1} \cdot (\frac{{dp}_{1} \cdot {dc}_{2}^{2}}{{dp}_{2} \cdot {dc}_{1}^{2}})

Über diese Formel hinaus, darf der Fluss bei isokratischen Methoden noch um ±50% angepasst werden, ohne das eine Revalidierung erforderlich ist.

Anpassung der Gradientenzeit

Im Falle eines Gradienten muss neben der Flussrate auch die Gradientenzeit t_G für jedes Segment des Gradienten angepasst werden. Dabei spielen sowohl die Länge L und der Innendurchmesser dc als auch die ermittelte Flussrate F₂ eine Rolle. Die Gradientenzeit kann über folgende Formel berechnet werden:

t_{G2} = t_{G1} \cdot \frac{F_{1}}{F_{2}} \cdot (\frac{L_{2} \cdot {dc}_{2}^{2}}{L_{1} \cdot {dc}_{1}^{2}})

Änderung des Injektionsvolumens

Eine Änderung der Säulenabmessung (Länge L und Innendurchmesser dc) haben zwangsläufig auch eine Änderung des Injektionsvolumens zur Folge. Dabei spielt es keine Rolle, ob es sich um eine isokratische oder Gradienten Methode handelt. Das angepasste Injektionsvolumen kann über folgende Formel berechnet werden:

V_{2} = V_{1} \cdot (\frac{L_{2} \cdot {dc}_{2}^{2}}{L_{1} \cdot {dc}_{1}^{2}})

Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase

Isokratische Methode

Die Komponente mit geringeren Anteilen (≤50%) darf relativ um ±30% angepasst werden aber absolut nicht ±10% übersteigen.

Beispiel: Bei einer 50/50 Mischung wären 30% von 50 eine Änderung von 15%. Dies wäre nicht erlaubt und daher darf sich die Zusammensetzung maximal um 10%, also im Bereich von 60/40 bis 40/60, ändern.

Gradienten Methode

Bei Gradienten soll der Hauptpeak innerhalb von ±15% der Retentionszeit eluieren. Dies gilt jedoch nicht, wenn die Dimensionen der Säule geändert wurden. Wenn die Dimension der Säule geändert wurde soll die mobile Phase so gewählt werden, dass der erste Peak ausreichend retardiert und der letzte Peak eluiert wird.

Änderung weiterer Paramater

Säulentemperatur

Die Temperatur darf bei isokratischen Methoden um ±10°C angepasst werden. Bei Gradienten Methoden darf die Temperatur um ±5°C variiert werden.

pH der mobilen Phase

Der pH Wert der mobilen Phase darf sowohl bei isokratischen als auch Gradienten Methoden um ±0.2 Einheiten variiert werden.

Salzkonzentration

Die Salzkonzentration in der mobilen Phase darf maximal um ±10% variieren aber das Limit der pH Abweichung muss dabei eingehalten werden.

Wellenlänge des Detektors

Die Wellenlänge des Detektors darf nicht geändert werden.